分子标记常见问题及其对策

1 显性标记与选择效率

  　一部分分子标记系统如RAPD、AFLP具有显性或部分显性的特点，无法区分基因是纯合还是杂合，不能提供完整的遗传信息。Haley等（1994）提出相斥相（Repulsion－phase）的RAPD标记无论对显性还是隐性均可极大地提高选择效率，他们找到了和菜豆普通花叶病毒抗性基因bc-3连锁相引标记-1，相斥标记bc-2，用标记-1选择纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26.3%，72.5%和1.2%，用标记-2选择分别占81.8%，18.2%和0，当两个标记同时使用时，即相当于一个共显性标记，与标记2的选择效率相同。这种方法解决了MAS中，显性标记不能区分纯合、杂合基因型的缺陷。

2 基因型限制

　 最有价值的标记是在广泛的基因背景下都能表表达，并能检测出来的标记。然而，目的基因与标记的连锁距离因遗传背景的不同而存在差异。标记与目的基因的遗传距离是影响辅助选择效率的一个重要因素。菜豆上，来源于Andean的抗性基因的RAPD标记在Middle America的遗传背景下表现紧密连锁，反之也成立。但在供体遗传背景下，RAPD标记就失去了选择能力。Andean中OA141100不能用来选择UP-2基因，OA141100标记的应用被局限在Middle America内。RAPD标记连锁距离的差异,影响了在不同遗传背景下的选择效果，寻找无重组的RAPD标记或将RAPD标记转化为RFLP标记，可以解决这个问题。

3 标记的稳定性和可操作性

   常用分子标记技术在基因标记等方面发挥了巨大作用，却存在一些缺点，如RFLP、AFLP等，成本高，操作繁琐，周期长，又有放射性污染，不适合于大样本选择。RAPD虽无上述缺点，但却存在稳定性差的弊端，将它们转化为特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）或称目标性状位点（Sequence Tagged Sites，STS）可以解决这些缺点。主要包括以下两种1）酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）对RFLP探针的两端测序，合成22引物进行PCR扩增，扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。2）序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR），对RAPD片段两端测序，根据所测DNA序列，合成24bp双引物进行PCR扩增。SCAR、CAP可以降低成本，操作简便，稳定性强，对仪器要求低，适合于大样本、快速分析。

                                                       中国农业生物技术创新中心

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