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分子标记技术
标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。与育种有关的遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological
markers）、生化标记（Biochemical
marker）和分子标记（molecular marker）。早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息
一、常用的分子标记技术
利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有十多种，主要有两大类。
一、基于Southern杂交的分子标记
这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行Southern杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。主要有（一）限制性片段长度多态性（Restriction
Fragment Length Polymorphism）
限制性片段长度多态性， 简称RFLP，是出现最早，应用最广泛的DNA标记技术之一。RFLP标记非常稳定，它是一种共显性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。多种农作物的RFLP分子遗传图谱已经建成。但其分析所需DNA量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。
 
图7-1
RFLP检测变异的原理
图7-2 RFLP图谱
（二）小卫星DNA（Minisatellite
DNA）
小卫星DNA（Minisatellite
DNA）又称数目可变串联重复序列（Variable
Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序列，为10-几百核苷酸，拷贝数10-10000不等。多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出。其缺点是多态性分布集中，合成探针困难，应用并不广泛。
图7-3
小卫星DNA检测变异原理
二、基于PCR技术的分子标记
（一）随机扩增片段长度多态性DNA （Random
Amplified Polymorphic DNA）
随机扩增片段长度多态性DNA，简称RAPD技术，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。与其它标记相比,RAPD具有以下优点： 1）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析。 2）操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖基因组的分析
3）不需制备探针、杂交等程序，成本较低。
4）DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用（惠东威，1992）。RAPD是一种显性标记，分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。
图7-4
RAPD图谱
（二）特异性扩增子多态性（Specific Amplificon
Polymorphism，SAP）
RFLP技术成本高，实验步骤多，周期长；RAPD标记稳定性较差，不利于育种中应用。在用RFLP和RAPD分析找到多态性DNA片段以后，将它们转化为特异性扩增子多态性（Specific
Amplificon Polymorphism，SAP）或称序标位（Sequence
Tagged Sites，STS）可以解决这些缺点。主要包括以下两种：
1）酶切扩增多态性序列（Cleaved
Amplified Polymorphic Sequence，CAP）将RFLP探针的两端测序，合成22-mer引物进行PCR扩增，扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。
2）序列特异性扩增区（Sequence-characterized
Amplified Region，SCAR）和位点特异相关引物（Allele－Specific
Associated Primers，ASAP），对RAPD、AFLP片段两端测序，根据DNA序列，合成24-mer双引物进行PCR扩增。SCAR、CAP可以降低了成本，操作简便，稳定性强，对仪器要求低，可实现自动化分析，适合于大样本的快速分析。
（三）简单重复序列（Simple
Sequence Repeat，SSR）
简单重复序列（Simple Sequence
Repeat，SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite
Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem
Repeat Polymorphism，STRP）。在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
（四）扩增片段长度多态性（Amplified
Fragment Length Polymorphism，AFLP）
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment
Length Polymorphism，AFLP），又称选择性限制片段扩增（Selective
Restriction Fragment Amplification）。先将DNA用内切酶酶解，然后接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物，即接头+酶切位点+2-3个核苷酸，然后进行特异性PCR扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。
图7-5
AFLP的银染检测结果
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